角质细胞生长因子联合低氧诱导因子1α对低氧应激大鼠小肠隐窝上皮细胞的保护作用及其机制

摘要：目的 探讨角质细胞生长因子(KGF)联合低氧诱导因子1α(HIF-1α)对低氧应激大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)的保护作用及其机制. 方法 (1)取常规培养大鼠IEC-6细胞,根据随机数字表法分为常氧空白组、常氧KGF组、常氧HIF-1α组和常氧联合组,分别更换DMEM培养基、含0.5 ng/mL KGF培养基、含10.0 ng/mL HIF-1α培养基及同时含0.5 ng/mL KGF和30.0 ng/mL HIF-1α培养基,放入氧气体积分数为21％的细胞培养箱培养24 h.(2)另取常规培养大鼠IEC-6细胞,根据随机数字表法分为常氧对照组、低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组.常氧对照组细胞更换DMEM培养基,并常规培养24 h;低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞分别更换DMEM培养基、含0.5 ng/mL KGF培养基、含10.0 ng/mL HIF-1α培养基及同时含0.5 ng/mL KGF和30.0 ng/mL HIF-1α培养基,并置于氧气体积分数为5％的三气培养箱中低氧培养24 h.取常氧及低氧处理各组细胞,样本数为3,光学显微镜下观察细胞形态学变化.取常氧及低氧处理各组细胞,样本数为3,细胞计数试剂盒8检测细胞存活率.取常氧对照及低氧处理各组细胞,样本数为3,流式细胞仪检测细胞周期变化及凋亡水平,紫外分光光度计和蛋白质印迹法分别检测细胞ATP含量和p53蛋白表达水平.对数据行单因素方差分析及LSD检验. 结果 (1)培养24 h后,常氧处理各组细胞均生长良好,细胞呈圆形或椭圆形,胞质清晰;低氧处理各组细胞均出现梭形、星形等不规则形态,胞质有黑色颗粒沉着.(2)培养24 h后,常氧空白组、常氧KGF组、常氧HIF-1α组及常氧联合组细胞存活率分别为(107.4±8.7)％、(109.8±2.9)％、(115.8±7.4)％、(112.8±10.6)％,组间总体比较,差异无统计学意义(F =0.685,P=0.586).培养24 h后,低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞存活率分别为(35.1±4.6)％、(52.9±6.8)％、(56.2±3.1)％、(71.2±9.6)％,均显著低于常氧对照组的(106.3±12.3)％,P＜0.001.低氧KGF组、低氧HIF-1α组及低氧联合组细胞存活率均明显高于低氧对照组(P=0.023、0.009、＜0.001),低氧联合组细胞存活率明显高于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.017、0.045).(3)培养24 h后,低氧对照组G1期细胞百分比显著高于常氧对照组(P=0.030),低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组S期细胞百分比显著低于常氧对照组(P =0.020、0.031、0.026),其余各组各期细胞百分比与常氧对照组相近(P =0.516、0.107、0.052、0.985、0.637、0.465、0.314、0.591).培养24 h后,低氧对照组、低氧KGF组及低氧HIF-1α组G1期细胞百分比明显高于低氧联合组(P=0.001、0.030、0.014),且S期细胞百分比显著低于低氧联合组(P=0.001、0.012、0.010).(4)培养24 h后,与常氧对照组比较,低氧对照组细胞凋亡率明显升高(P =0.018),低氧联合组细胞凋亡率明显降低(P=0.008).培养24 h后,与低氧对照组比较,低氧KGF组和低氧联合组细胞凋亡率明显降低(P=0.004、0.001);低氧联合组细胞凋亡率明显低于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.032、0.002).(5)培养24 h后,与常氧对照组比较,低氧联合组细胞ATP含量无明显变化(P=0.209),其余各组细胞ATP含量均明显降低(P=＜0.001、0.001、0.002);与低氧对照组比较,低氧HIF-1α组和低氧联合组细胞ATP含量明显升高(P=0.044、0.001);低氧联合组细胞ATP含量明显高于低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.011、0.020).(6)培养24 h后,与常氧对照组比较,低氧对照组、低氧KGF组、低氧HIF-1α组细胞p53蛋白表达量明显升高(P＜0.001),低氧联合组细胞p53蛋白表达量显著低于低氧对照组、低氧KGF组和低氧HIF-1α组(P=0.001、0.001、0.002). 结论 KGF联合HIF-1α对低氧应激大鼠IEC-6细胞具有显著的保护作用,可通过降低其细胞周期阻滞程度及凋亡水平,提高细胞的能量代谢水平,从而促进低氧环境下细胞的存活.