异体皮肤成纤维细胞在糖尿病小鼠创面愈合中的作用及其机制

摘要：目的 探讨异体皮肤成纤维细胞(Fb)在促进糖尿病小鼠创面愈合中的作用及其机制.方法 (1)实验1.取糖尿病小鼠及健康小鼠各10只,处死后取背部皮肤组织,制备第4代正常皮肤Fb及糖尿病皮肤Fb悬液.另取27只糖尿病小鼠,按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组,每组9只,于背部制作面积为1 cm×l cm的全层皮肤缺损创面.伤后即刻,分别于正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面4个角注射制备的正常皮肤Fb和糖尿病皮肤Fb悬液各200 μL,PBS组小鼠分别于相同位置注射等量PBS.伤后3、7、10、14、17d,取3组存活小鼠进行创面大体观察并计算创面愈合率.伤后7、14 d,每组各取行创面大体观察后的3只小鼠处死,取创面组织.免疫荧光法检测创面组织Ki-67阳性细胞百分比,免疫组织化学法检测创面组织微血管密度(MVD),Masson染色检测创面组织胶原纤维沉积量.(2)实验2.取糖尿病小鼠及健康小鼠各10只,同实验1制备原代、第4代正常皮肤Fb及原代、第4代糖尿病皮肤Fb.采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、晚期糖基化终末产物(AGE)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、神经激肽l的mRNA和蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析及LSD-t检验. 结果 (1)正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠伤后各时间点创面干燥、结痂速度较PBS组快.伤后17 d,正常皮肤Fb组小鼠创面愈合率与PBS组相近(t=3.45,P＞0.05),其余各时间点正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面愈合率明显高于PBS组(t =9.15、10.25、35.28、6.79、8.37、10.69、22.53、6.70、4.47,P＜0.05或P ＜0.01).伤后7、14 d,正常皮肤Fb组小鼠创面愈合率明显高于糖尿病皮肤Fb组(t=4.41、4.16,P＜0.05).伤后7、14 d,正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面组织Ki-67阳性细胞百分比明显高于PBS组(t=20.89、31.82、4.86、29.53,P＜0.05或P＜0.01),正常皮肤Fb组小鼠创面组织Ki-67阳性细胞百分比明显高于糖尿病皮肤Fb组(t=8.78、13.51,P＜0.05或P＜0.01).伤后7、14 d,正常皮肤Fb组、糖尿病皮肤Fb组小鼠创面组织MVD明显高于PBS组(t=26.92、56.42、10.36、26.85,P＜0.01).伤后14 d,正常皮肤Fb组小鼠创面组织MVD明显高于糖尿病皮肤Fb组(t =8.61,P＜0.01).伤后7、14 d,正常皮肤Fb组小鼠创面组织胶原纤维沉积量明显高于糖尿病皮肤Fb组及PBS组(t=10.09、5.48、4.77、3.14,P＜0.05或P＜0.01).(2)原代正常皮肤Fb凋亡率为(5.61±0.18)％,与第4代正常皮肤Fb凋亡率相近[(6.48±0.16)％,t=1.44,P=0.06].原代糖尿病皮肤Fb凋亡率为(26.25 ±0.56)％,明显高于原代正常皮肤Fb(t=36.61,P＜0.01),与第4代糖尿病皮肤Fb相近[(25.68±0.93)％,t=0.91,P=0.41].原代正常皮肤Fb的TGF-β1及神经激肽1 mRNA表达量明显高于原代糖尿病皮肤Fb(t =25.25、273.30,P＜0.01),AGE及MMP-9 mRNA表达量明显低于原代糖尿病皮肤Fb(t=23.01、8.84,P＜0.05或P＜0.01).原代糖尿病皮肤Fb的TGF-β1、AGE及神经激肽1 mRNA表达量明显高于第4代糖尿病皮肤Fb(t=4.34、22.84、12.10,P＜0.05或P＜0.01).原代正常皮肤Fb的TGF-β1及神经激肽1蛋白表达量明显高于原代糖尿病皮肤Fb(t =4.61、8.53,P＜0.05),AGE及MMP-9蛋白表达量明显低于原代糖尿病皮肤Fb(t=10.22、29.90,P＜0.01).原代糖尿病皮肤Fb的AGE及神经激肽l蛋白表达量明显高于第4代糖尿病皮肤Fb(t=8.09、4.36,P＜0.05或P＜0.01). 结论 异体皮肤Fb可通过促进创面Fb增殖、血管生成、胶原纤维沉积等促进糖尿病小鼠创面愈合,而小鼠糖尿病皮肤Fb在脱离糖尿病微环境进行体外培养后,细胞活性低于正常皮肤Fb,因而促进创面愈合的作用不如正常皮肤Fb.