不同激活剂对人富血小板血浆形成凝胶及释放活性物质影响的实验研究

摘要：目的 探讨葡萄糖酸钙和凝血酶对人富血小板血浆(PRP)形成富血小板凝胶(PRG)与释放生物活性物质的影响以及临床意义.方法 2016年5-8月,笔者单位招募符合入选标准的6名健康献血志愿者,采集每名志愿者血小板制备PRP.(1)每名志愿者取10 mL PRP,按照随机数字表法分为凝血酶激活组5 mL、葡萄糖酸钙激活组5 mL,凝血酶激活组加入100 U/mL凝血酶溶液0.5 mL、葡萄糖酸钙激活组加入100 g/L葡萄糖酸钙溶液0.5 mL,于37℃水浴中激活1h.记录PRG形成时间,观察激活1h内PRG的形成情况.激活1h,收集PRG,一部分行HE染色观察纤维蛋白分布,一部分于透射电镜下观察血小板超微结构;收集上清液,采用ELISA法检测TGF-p1、血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)、血管内皮生长因子、bFGF、EGF、胰岛素样生长因子Ⅰ的含量.(2)每名志愿者另取10 mL PRP同前分组,2次离心及2次PBS重新悬浮获得血小板悬液,同实验(1)加入相应激活剂处理1h.采用纳米颗粒跟踪分析仪检测血小板来源不同直径微囊泡浓度及总微囊泡浓度.对数据行t检验.结果 (1)凝血酶激活组PRG形成时间为(228±40)s,此时PRG体积大;激活30 min PRG体积回缩至小.葡萄糖酸钙激活组PRG形成时间为(690±71)s,此时PRG体积大;激活55 min PRG体积回缩至小.凝血酶激活组PRG形成时间明显短于葡萄糖酸钙激活组(t=15.17,P＜0.01).(2)HE染色显示,激活1h,凝血酶激活组PRG中纤维蛋白红染面积大,密集分布;葡萄糖酸钙激活组PRG中纤维蛋白红染面积小,松散分布.透射电镜显示,激活1h,凝血酶激活组PRG中血小板均呈碎片状;葡萄糖酸钙激活组PRG中可见正在裂解的血小板、α颗粒结构及未裂解的α颗粒、致密体结构.(3)凝血酶激活组PRP释放的PDGF-BB含量为(7.4±0.8)ng/mL,明显高于葡萄糖酸钙激活组[(4.9±0.5)ng/mL,t=5.41,P＜0.01].葡萄糖酸钙激活组PRP释放的bFGF含量为(960±151) pg/mL,明显高于凝血酶激活组[(384±56) pg/mL,t=8.75,P＜0.01].2组PRP释放的其余4种生长因子含量相近(t值为0.11 ～1.97,P值均大于0.05).(4)葡萄糖酸钙激活组血小板来源的总微囊泡、直径大于100 nm微囊泡、直径小于或等于100 nm外泌体的浓度分别为(165.8±15.1)×108/mL、(142.4±12.3)×108/mL、(23.4±2.9)×108/mL,均明显高于凝血酶激活组[分别为(24.7±4.6)×108/mL、(22.6±4.0)×108/mL、(2.1±0.7) ×108/mL,t值为17.36～22.66,P值均小于0.01].结论 葡萄糖酸钙缓慢激活PRP,形成的PRG回缩缓慢、释放高含量的bFGF和高浓度的微囊泡,宜于修复关节腔及窦道性创面;凝血酶快速激活PRP,形成的PRG回缩较快,释放高含量的PDGF-BB和一定浓度的微囊泡,宜于修复急性创伤.