短暂高糖环境暴露对人真皮微血管内皮细胞生物学行为的影响

摘要：目的 观察短暂高糖环境暴露对体外培养人真皮微血管内皮细胞生物学行为的影响.方法 本研究所有检测指标对应的细胞分组及处理如下:将第4代人真皮微血管内皮细胞按随机数字表法分成3组,每组12孔.对照组细胞采用含5 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液培养7d;短暂高糖组细胞在含30 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液中培养2d,再改用含5 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液继续培养5d;长时高糖组细胞采用含30 mmol/L D-葡萄糖的完全培养液培养7d.(1)采用倒置光学显微镜观察对照组和长时高糖组培养7d以及短暂高糖组培养2、7d细胞形态学变化.(2)培养0、2、4、7d,采用细胞存活率分析计数器检测细胞增殖率.(3)培养2d后进行划痕实验,划痕后继续培养,于划痕后0、24、48、72、96、120 h测量划痕面积,计算后5个时相点细胞迁移率.(4)培养0、2、4、7d,采用细胞分析仪检测细胞凋亡率.(5)培养7d后再在基质胶上培养24 h,采用倒置光学显微镜观察血管样结构形成情况,并计算血管样结构长度、分叉点数量.(6)培养2、4、7d,采用实时荧光定量RT-PCR法检测血管化相关基因基质金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP-3)mRNA表达.对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD检验. 结果 (1)对照组细胞培养7d,细胞呈卵圆形,铺路石样排列.短暂高糖组细胞培养2d,形态变细长,排列丧失铺路石样;培养7d仍保持细长,丧失铺路石样排列.长时高糖组细胞培养7d,形态变细长,排列丧失铺路石样.(2)培养0d,3组细胞增殖率差异无统计学意义(F=0.23,P＞0.05).培养2d,短暂高糖组和长时高糖组细胞增殖率相近(P＞0.05),且均低于对照组(P值均小于0.01);培养4、7d,短暂高糖组和对照组细胞增殖率相近(P值均大于0.05),且均高于长时高糖组(P值均小于0.01).(3)划痕后24～ 120 h,短暂高糖组和长时高糖组细胞迁移率均相近(P值均大于0.05),且均低于对照组(P值均小于0.01).(4)培养0d,3组细胞凋亡率差异无统计学意义(F=0.78,P＞0.05).培养2d,短暂高糖组和长时高糖组细胞凋亡率相近(P＞0.05),且均高于对照组(P值均小于0.01);培养4、7d,短暂高糖组和对照组细胞凋亡率相近(P值均大于0.05),且均低于长时高糖组(P值均小于0.01).(5)短暂高糖组和长时高糖组细胞形成血管样结构长度分别为(1.84±0.10) ×105、(1.82±0.11) ×105 μm(P＞0.05),均短于对照组的(2.75±0.23) ×105 μm(P值均小于0.01);短暂高糖组和长时高糖组细胞形成血管样结构分叉点数量分别为(43±5)、(46 ±8)个(P＞0.05),均少于对照组的(103 ±21)个(P值均小于0.01).(6)培养2、4、7d,短暂高糖组和长时高糖组细胞TIMP-3的mRNA表达量相近(P值均大于0.05),且均低于对照组(P值均小于0.05). 结论 短暂高糖环境暴露能诱导体外培养的人真皮微血管内皮细胞形态、迁移和血管形成发生“代谢记忆”从而导致其产生持久的生物学行为变化,其机制可能与调控血管化相关基因发生改变有关.