人脐带间充质干细胞培养上清液与环丙沙星体外联合应用对金黄色葡萄球菌的作用

摘要：目的 探讨联合应用人脐带间充质干细胞(hUCMSC)培养上清液与环丙沙星对金黄色葡萄球菌的作用. 方法 取足月剖宫产健康胎儿的脐带组织,分离、培养、鉴定hUCMSC后选取第3代细胞进行实验;取笔者单位烧伤患者创面分离培养的金黄色葡萄球菌菌株用于以下实验.按随机数字表法(下同)将细胞分为0、10、100、1 000 ng/mL LPS组,添加相应质量浓度LPS处理12h后,换为间充质干细胞(MSC)培养液培养,培养6、12、24 h,每组收集6孔细胞培养上清液,ELISA法测定LL-37含量.将90个血琼脂平板培养基分为环丙沙星对照组、环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组,每组30个.环丙沙星对照组培养基涂布1.5×108 CFU/mL生理盐水配制的菌液;环丙沙星+上清液组培养基涂布1.5×108 CFU/mL由生理盐水和2倍生理盐水体积的hUCMSC培养上清液(用MSC培养液培养,下同)配制的菌液;环丙沙星+上清液+LL-37抗体组培养基涂布1.5×108 CFU/mL由生理盐水和2倍生理盐水体积的hUCMSC培养上清液配制的菌液,菌液中加入2 μg/mL LL-37抗体2.6 μL.培养12、24、48 h,每组取10个血琼脂平板培养基,观察血琼脂平板培养基上金黄色葡萄球菌菌落分布情况,测量环丙沙星抑菌环直径,读取环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MIC.计算环丙沙星+上清液组和环丙沙星+上清液+LL-37抗体组培养12、24、48 h时环丙沙星的部分抑菌浓度(FIC)指数并评定协同效果.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验. 结果 (1)培养各时相点,10、100、1 000 ng/mL LPS组细胞培养上清液中LL-37含量均较0 ng/mL LPS组高(t值为11.22 ～33.36,P值均小于0.01),100、1 000 ng/mL LPS组细胞培养上清液中LL-37含量均较10 ng/mL LPS组高(t值为2.24 ～ 18.73,P ＜0.05或P＜0.01),1 000 ng/mL LPS组细胞培养上清液中LL-37含量均较100 ng/mL LPS组高(t值为12.46 ～14.70,P值均小于0.01).(2)培养12、24、48 h,环丙沙星对照组、环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组血琼脂平板培养基中细菌菌落随时间延长逐渐融合.环丙沙星对照组培养12、24、48 h环丙沙星抑菌环直径变化不大,分别为26、24、23 mm.环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组培养12、24、48 h环丙沙星抑菌环直径分别为82、71、68 mm和74、59、56 mm,明显大于环丙沙星对照组.(3)培养各时相点,环丙沙星对照组环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MIC明显大于环丙沙星+上清液组和环丙沙星+上清液+LL-37抗体组(Z值为6.22～6.71,P值均小于0.01);环丙沙星+上清液+LL-37抗体组环丙沙星对金黄色葡萄球菌的MIC均明显大于环丙沙星+上清液组(Z值均为6.72,P值均小于0.01).(4)环丙沙星+上清液组、环丙沙星+上清液+ LL-37抗体组培养12、24、48 h时环丙沙星的FIC指数分别为0.011、0.032、0.032,0.122、0.350、0.350,即hUCMSC培养上清液对环丙沙星产生了协同抗菌作用. 结论 hUCMSC能够分泌LL-37且分泌水平随着LPS浓度的增加而提高.hUCMSC培养上清液联合环丙沙星抗金黄色葡萄球菌,可以有效降低环丙沙星用量,中和LL-37后,hUCMSC培养上清液的协同抗菌作用降低.