雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响及其分子机制

摘要：目的 探讨雷帕霉素对人表皮细胞株HaCaT迁移的影响,并初步分析其分子机制.方法 采用含体积分数10％ FBS的RPMI 1640培养液(简称培养液)常规培养HaCaT细胞.(1)取对数生长期细胞,按照随机数字表法将其分为对照组及1、5、50、100、200 nmol/L雷帕霉素组,每组6孔.5个雷帕霉素组细胞分别加入含相应质量浓度雷帕霉素的培养液,对照组细胞加入含二甲基亚砜(DMSO)的培养液.常规培养4h后,采用酶标仪检测细胞增殖活性(以吸光度值表示).(2)取对数生长期细胞,同实验(1)分组培养,每组1孔.常规培养4h后,在活细胞工作站下观察各组细胞3h内运动范围,计算细胞曲线运动速度,筛选雷帕霉素适宜实验浓度.(3)取对数生长期细胞,按随机数字表法将其分为雷帕霉素组和对照组,每组1孔.雷帕霉素组细胞加入含50 nmol/L雷帕霉素的培养液,对照组细胞加入含DMSO的培养液.常规培养4h后行划痕实验,观察划痕后0(即刻)、5、10、15 h的划痕面积并计算后3个时相点的细胞迁移率.(4)取对数生长期细胞,同实验(3)分组培养,每组1孔.用蛋白质印迹法检测细胞黏着斑激酶(FAK)活性(以磷酸化FAK与FAK灰度值比值表示).上述实验重复3次或5次.对数据行单因素方差分析、LSD检验、t检验.结果 (1)对照组及1、5、50、100、200 nmol/L雷帕霉素组细胞增殖活性分别为1.22 ±0.28、1.29 ±0.38、1.12±0.27、1.20±0.29、1.15 ±0.30、1.39 ±0.40,组间比较差异无统计学意义(F=2.112,P=0.068).(2)1、5 nmol/L雷帕霉素组细胞的运动范围与对照组接近,其余3个雷帕霉素组细胞的运动范围明显小于对照组.组间细胞曲线运动速度总体比较,差异有统计学意义(F=3.525,P=0.004).1、5 nmol/L雷帕霉素组细胞曲线运动速度分别为(0.8±0.4)、(0.8±0.8) μm/min,与对照组[(0.9±0.5) μm/min]相近(P值均大于0.05);50、100、200 nmoL/L雷帕霉素组细胞曲线运动速度分别为(0.7±0.5)、(0.7±0.4)、(0.7±0.4)μm/min,明显慢于对照组(P值均小于0.01).选择50 nmol/L雷帕霉素用于后续实验.(3)划痕后0、5h,雷帕霉素组细胞划痕面积与对照组相近;划痕后10、15h,雷帕霉素组细胞划痕面积较对照组大.划痕后5h,对照组及雷帕霉素组的细胞迁移率分别为(17.5±2.6)％、(15.8±3.5)％,组间比较差异无统计学意义(t=1.951,P＞0.05).雷帕霉素组划痕后10、15 h的细胞迁移率分别为(42.5±4.0)％、(71.3±9.2)％,明显低于对照组的(46.9±6.7)％、(88.0±7.7)％,t值分别为2.732、6.746,P值均小于0.01.(4)雷帕霉素组细胞FAK活性为0.16 ±0.08,明显低于对照组的0.46±0.14,t=4.967,P＜0.01.结论 在HaCaT细胞中,FAK信号通路对雷帕霉素敏感,FAK活性下降可能参与介导雷帕霉素对HaCaT细胞迁移的抑制效应.