P311和转化生长因子β1相互作用及其对小鼠成纤维细胞功能的影响

摘要：目的 探讨P311和TGF-β1在小鼠皮肤Fb中的相互作用及其对Fb功能的影响.方法 取P311野生型和P311基因敲除型C57BL/6新生小鼠各5只,分离培养2种小鼠皮肤Fb.采用第2代Fb完成以下实验,每个实验重复3次.(1)取P311野生型小鼠Fb,按随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组和P311过表达组,每组36孔.空白对照组每孔加入10 μL空载体腺病毒,P311过表达组每孔加入等效价P311腺病毒表达载体.培养48 h后,采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测2组Fb的P311 mRNA及TGF-β1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量(检测方法下同).(2)取P311野生型和P311基因敲除型小鼠Fb各4瓶,待细胞生长至80％ ～90％融合时,检测2种Fb的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量.(3)取P311野生型小鼠Fb用体积分数为1％ FBS的DMEM培养液饥饿处理3h后,分为空白对照组及5、10、15、20、25 ng/mL TGF-β1组,每组2瓶.空白对照组常规培养,后5组Fb分别加入5、10、15、20、25 ng/mL TGF-β1溶液,培养48 h后检测6组Fb的P311 mRNA表达量.另取P311野生型小鼠Fb,分为空白对照组和10 ng/mL TGF-β1组,每组6孔,免疫荧光法检测2组Fb的P311蛋白表达情况.(4)将P311野生型小鼠Fb同前饥饿处理后,分为空白对照组和10 ng/mL TGF-β1组,每组2瓶,空白对照组常规培养,后组加入10 ng/mL的TGF-β1溶液,培养48 h后,检测2组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量.取P311基因敲除型小鼠Fb,同前分组及处理后,检测2组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量.对数据行单因素方差分析、t检验. 结果 (1)P311过表达组Fb的P311 mRNA表达水平较空白对照组增高近30万倍(t=9.942,P＜0.001).P311过表达组Fb的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA,以及TGF-β1前体、TGF-β1活化态、α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达量均较空白对照组明显升高(t值为8.192～49.090,P值均小于0.01).(2) P311基因敲除型小鼠Fb的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA表达量较P311野生型小鼠Fb明显降低(t值为8.157 ～22.270,P值均小于0.01).P311基因敲除型小鼠Fb的TGF-β1前体、α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达量较P311野生型小鼠Fb明显降低(t值为2.995 ～12.600,P＜0.05或P＜0.01),2种Fb的TGF-β1活化态蛋白表达量相近(t=1.070,P＞0.05).(3)空白对照组及5、10、15、20、25 ng/mLTGF-β1组Fb的P311 mRNA表达量分别为1.28±0.44、3.61±0.91、6.64±0.92、6.58±1.04、1.79±0.31、0.16±0.06.与空白对照组Fb的P311 mRNA表达量比较,5、20 ng/mL TGF-β1组无明显变化(t值分别为2.302、0.955,P值均大于0.05),10、15 ng/mL TGF-β1组明显增高(t值分别为5.630、4.710,P值均小于0.001),25 ng/mL TGF-β1组明显降低(t=2.509,P＜0.01).10 ng/mL TGF-β1组Fb的P311蛋白表达明显强于空白对照组.(4) P311野生型小鼠10 ng/mL TGF-β1组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高(t值为3.523～14.290,P ＜0.05或P＜0.01).P311基因敲除型小鼠10 ng/mL TGF-β1组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高(t值为4.895～ 14.870,P＜0.05或P＜0.01).结论 P311和TGF-β1在小鼠皮肤Fb中存在相互作用,可共同促进Fb的分化.