腺病毒介导的人表皮生长因子基因转染对人表皮细胞生物学特性的影响

摘要：目的 观察腺病毒介导的人EGF(Ad-hEGF)基因转染人表皮细胞的合适条件及转染对该细胞生物学特性的影响. 方法 取包皮环切术后弃用的新鲜人体包皮组织,通过酶消化法分离人表皮细胞,传代培养,采用第3代细胞进行以下实验.(1)按随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为未转染组及5、20、50、100、150、200倍转染组,每组3孔.未转染组不转染Ad-hEGF基因,后6组分别按感染复数(MOI)5、20、50、100、150、200转染Ad-hEGF基因.转染24、48、72 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态,倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达.(2)另取3个批次细胞,分别同前分组处理,分别于转染24、48、72 h,流式细胞仪检测Ad-hEGF基因转染率(样本数为3),ELISA法检测收集的细胞培养上清液中EGF质量浓度(样本数为6),细胞计数试剂盒8(CCK8)及酶标仪检测细胞增殖活性(样本数为6).(3)另取细胞分为未转染组和转染组,每组6 孔.未转染组用未转染细胞的细胞培养上清液孵育,转染组用以佳MOI(50)转染Ad-hEGF基因细胞的细胞培养上清液孵育,分别于孵育1、3、5 d,CCK8及酶标仪检测细胞分泌的EGF生物活性.(4)另取细胞分为未转染组和转染组,每组12孔.未转染组不转染Ad-hEGF基因,转染组以佳MOI(50)转染Ad-hEGF基因.转染24 h,免疫荧光染色法检测细胞角蛋白14(CK14)、CK19表达.(5)另取细胞,同(4)分组(每组6孔)处理,于划痕后0(即刻)、12、24、48 h,倒置相差显微镜下观测细胞迁移距离.对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、LSD检验. 结果 (1)转染24、48 h,各转染组细胞形态与未转染组比较,无明显改变;转染72 h,200倍转染组的细胞碎片较未转染组明显增多.转染24、48、72 h,未转染组细胞未见绿色荧光蛋白表达,各转染组绿色荧光蛋白阳性细胞数随转染时间延长逐渐增多.(2)各转染组细胞Ad-hEGF基因转染率随转染时间延长逐渐增高.转染72 h,50～ 200倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率均大于90％;未转染组及5、20倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率则分别为(0.51±0.20)％、(62.44±6.23)％、(75.00±5.43)％,明显低于50倍转染组的(93.12±2.55)％,P值均小于0.01.随着转染时间的延长,各转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度逐渐增高;转染72 h,50倍转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度明显高于其余各组(P值均小于0.01).转染24、48 h,各组细胞增殖活性相近(P值均大于0.05);转染72 h,200倍转染组细胞增殖活性明显低于其余各组(P值均小于0.05).(3)孵育1d,2组细胞分泌的EGF生物活性相近(P＞0.05);孵育3、5d,转染组细胞分泌的EGF生物活性明显高于未转染组(P值均小于0.01).(4)转染24 h,转染组细胞CK14、CK19表达较未转染组增强.(5)划痕后0h,2组细胞划痕宽度基本一致.划痕后12～48 h,转染组细胞迁移距离明显长于未转染组(P值均小于0.01). 结论 Ad-hEGF基因转染人表皮细胞的合适MOI为50～ 150,以50为佳,以此MOI转染既能高效表达目的基因,又可保持细胞良好的增殖、分化和迁移能力.