微管解聚对大鼠心肌细胞自主搏动和动作电位的影响及其机制

摘要：目的 观察微管解聚对大鼠心肌细胞自主搏动频率、动作电位(AP)、耗氧量的影响并探究其机制. 方法 将180只SD大鼠乳鼠分12批处理进行实验,每批取15只大鼠乳鼠处死,剪取心脏组织分离培养心肌细胞,分别接种至1个铺有6块圆形盖玻片的12孔板、1个铺有6块方形盖玻片的l2孔板、2个细胞培养瓶、2个细胞培养皿.将培养3d的各容器中细胞按随机数字表法分为正常对照组(加入3 mL 37℃复温的DMEM/F12培养液,常规培养3h)和微管解聚组(加入3 mL37℃复温的含终浓度为8 μmol/L秋水仙碱的DMEM/F12培养液,常规培养3h),每组分别3孔、1瓶、l皿.免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞微管形态变化,蛋白质印迹法检测细胞游离态及聚合态α微管蛋白的含量变化.倒置显微镜下观察并计算细胞自主搏动频率.氧微电极监测系统测定含有心肌细胞的DMEM/F12培养液加入秋水仙碱前后的溶解氧浓度,另测定单纯培养液和秋水仙碱+培养液溶解氧浓度.采用全细胞膜片钳记录模式记录细胞AP、延迟整流型钾离子通道电流(IK)和L型钙离子通道电流(IC.L)变化,绘制电流密度-电压(I-V)曲线.对数据行独立或配对样本t检验. 结果 (1)正常对照组细胞微管结构完整,围绕核周呈放射状分布,线性管状结构清晰.微管解聚组细胞微管结构破坏,呈现弥散性分布,线性管状结构粗糙而不光滑.(2)微管解聚组细胞游离态α微管蛋白含量为0.61±0.03,明显高于正常对照组的0.46 ±0.03,t=-6.99,P ＜0.05;聚合态oo微管蛋白含量为0.57±0.04,明显低于正常对照组的0.88 ±0.04,t=9.09,P＜0.05.(3)微管解聚组细胞自主搏动频率为(59±8)次/min,较正常对照组的(41 ±7)次/min明显增加(t =5.62,P＜0.01).(4)含心肌细胞的培养液溶解氧浓度为(138.4±2.5) μmol/L,秋水仙碱处理后下降为(121.7±3.6) μmol/L,差异明显(t=26.31,P＜0.05).单纯培养液和秋水仙碱+培养液溶解氧浓度无明显差异(t=0.72,P＞0.05).(5)与正常对照组比较,微管解聚组细胞AP形态发生明显变化,复极化平台期不明显,动作电位时程(APD)明显缩短.微管解聚组细胞的APD20、APD50、APD90分别为(36.2±3.8)、(73.7±5.7)、(ll5.1±8.0)ms,较正常对照组的(40.2±2.3)、(121.4±7.0)、(169.4 ±5.6)ms明显缩短(t值分别为2.61、15.88、16.75,P值均小于0.05).(6)微管解聚组细胞IK的I-V曲线较正常对照组上移,激活后各测试电压(0～40 mY)下微管解聚组IK电流密度均高于正常对照组(t值为2.70～ 3.76,P值均小于0.05).(7)2组细胞I.L的I-V曲线基本重叠,激活后各测试电压(-30～ 50 mV)下ICa-L电流密度相近(t值为-1.57～1.66,P值均大于0.05). 结论 微管解聚后Ik增强,ICa-L变化不明显,使得AP复极化增快,进而缩短APD,加快大鼠心肌细胞自主搏动频率,增加其耗氧量.