外源性一氧化碳释放分子2对大肠杆菌活力及毒力的作用

摘要：目的 探讨外源性一氧化碳释放分子2(CORM-2)对大肠杆菌ATCC 25922菌株活力及毒力的作用及可能机制. 方法 (1)体外实验1.将菌株按照随机数字表法分为细菌组、细菌+1.2 mmol/L CORM-2组、细菌+1.6 mmol/L CORM-2组、细菌+1.2 mmol/L无活性CORM-2(iCORM-2)组、细菌+ 1.6 mmol/L iCORM-2组,每组样本数为6.细菌组不添加任何物质,其余4组添加相应浓度的CORM-2或iCORM-2.于培养0、3、5、8、10、12、16、20、24、27、30、48 h,测定各组菌液的增殖活性,结果以吸光度值(波长为600 nm)表示；同时进行菌落计数.(2)体外实验2.另取菌株,将其分为细菌组和细菌+0.8 mmol/L CORM-2组,采用基因芯片筛查出大肠杆菌的4个相关基因fliA、dnaK、marA和waaQ进行实时定量PCR(qRT-PCR),检测各基因表达量.(3)在体研究.另取菌株同体外实验1分组及处理,培养至细菌组菌液的吸光度值(波长600 nm)为0.4时,各组收集0.5 mL菌液.将72只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为空白对照组、细菌组、细菌+1.2 mmol/L CORM-2组、细菌+1.6 mmol/L CORM-2组、细菌+1.2 mmol/L iCORM-2组、细菌+1.6 mmol/L iCORM-2组,每组12只.空白对照组小鼠不行任何处理,其余5组小鼠取对应有或无添加物的0.5 mL菌液进行腹腔注射.注射后对后5组小鼠进行大体观察.注射后6、12 h检测后5组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平,注射后12 h收集小鼠肝、肺组织标本检测髓过氧化物酶(MPO)活性.空白对照组小鼠行相同检测.对数据进行重复测量设计方差分析、析因设计方差分析、单因素方差分析和t检验. 结果 (1)体外实验1.与细菌组和细菌+ 1.2 mmol/L iCORM-2组比较,细菌+1.2 mmol/L CORM-2组多数时相点细菌增殖活性明显受抑,菌落明显数量减少(F值分别为1170.80、217.52,P值均小于0.01)；与细菌组和细菌+ 1.6 mmol/L iCORM-2组比较,细菌+1.6 mmol/L CORM-2组多数时相点细菌增殖活性亦明显受抑,菌落数量亦明显减少(F值分别为7948.34、14 432.85,P值均小于0.01).(2)体外实验2.qRT-PCR检测结果显示:与细菌组比较,细菌+0.8 mmol/L CORM-2组fliA基因表达下调,dnaK、marA和waaQ基因表达上调(t值分别为30.28、-165.54、-168.88、-187.28,P值均小于0.01).(3)在体研究.细菌组和细菌+ 1.2 mmol/L iCORM-2组、细菌+1.6 mmol/L iCORM-2组小鼠出现诸如精神萎靡、呼吸急促等症状,细菌+ 1.2 mmol/L CORM-2组、细菌+1.6 mmol/L CORM-2组小鼠上述症状轻微或不明显.注射后6h,细菌组、细菌+1.2 mmol/L iCORM-2组小鼠血清TNF-α、IL-6水平分别为(647.3±3.8) pg/mL、(3.44±0.22) ng/mL以及(639.3±0.8)pg/mL、(2.47±0.32)ng/mL,明显高于细菌+ 1.2 mmol/L CORM-2组[(124.6±10.7) pg/mL、(1.03 ±0.16)ng/mL,t值为15.22～84.03,P值均小于0.01].与细菌组和细菌+1.6 mmol/L iCORM-2组比较,注射后6、12 h细菌+1.6 mmol/L CORM-2组小鼠血清TNF-α、IL-6水平亦均明显降低(t值为19.27～245.34,P值均小于0.01).注射后12 h,细菌+1.2 mmol/L CORM-2组小鼠肝、肺组织中MPO活性明显低于细菌组、细菌+ 1.2 mmol/L iCORM-2组,细菌+1.6 mmol/L CORM-2组小鼠肝、肺组织中MPO活性亦明显低于细菌组、细菌+ 1.6 mmol/L iCORM-2组(t值分别为17.36～18.92、2.35 ～3.61,P值均小于0.01).结论 CORM-2能够明显抑制大肠杆菌的活力和毒力,其抑制作用可能与其调节大肠杆菌部分重要的靶基因(fliA、dnaK、marA和waaQ)有关.