血管内皮生长因子165基因对真皮替代物血管化影响的实验研究

摘要：目的 研究血管内皮生长因子165(VEGF 165)基因对真皮替代物体内管化的影响.方法 采用含体积分数10％ FBS的M199培养基(简称完全培养基)培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC).(1)按随机数字表法将HUVEC分为3组,每组6孔:未转染组,不行转染；空载质粒组,转染pIRES2-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒；VEGF质粒组,转染pIRES2-EGFP-血管内皮生长因子(VEGF)质粒. 转染后24 h,倒置相差荧光显微镜下观察各组细胞中绿包荧光蛋白(GFP)表达情况,流式细胞仪检测各组细胞中GFP的表达率；未转染组行相同检测.以新霉素筛选出空载质粒组和VEGF质粒组稳转细胞进行实验.分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法、ELISA法检测3组细胞中VEGF 165 mRNA和蛋白表达以及细胞培养上清液中VEGF 165的蛋白含量. (2)按随机数字表法将48只雄性裸鼠分为4组,毎组12只:生理盐水组,背部两侧(部位下同)埋植经生理盐水培养2 d的真皮替代物；培养基组,埋植经完全培养基培养2 d的真皮替代物；未转染细胞组,埋植经含未转染HUVEC的完全培养基培养2 d的真皮替代物；转染细胞组,埋植经含VEGF质粒稳转HUVEC的完全培养基培养2 d的真皮替代物.埋植术后3、7、14和21 d取出各组真皮替代物,行免疫组织化学染色,观察其上微血管和HUVEC分布,计数术后14 d微血管数量；蛋白质印迹法检测真皮替代物中VEGF 165蛋白表达.各项检测及观察均重复进行3次,数据采用单因素方差分析和LSD法处理.结果 (1)转染后24h,仅在2个转染组细胞中观察到明显绿色荧光.细胞中GFP表达率:未转染组为0,空载质粒组(85 2±3.2)％,VEGF质粒组(93.1±2.4)％.未转染组、空载质粒组、VEGF质粒组细胞中VEGF 165 mRNA相对表达量分别为1、1.05 ±0.09、3.02 ±0.13(F＝5.28,P＜0.05),VEGF165蛋白相对表达量分别为0.78 ±0.16、0.76±0.13、1.92±0.18(F＝7.62,P＜0.05)；细胞上清液中VEGF 165蛋白含量分别为(62.4 ±2.7)、(73.1±3 8)、(117.5 ±3.1)pg/mL(F＝15.08,P＜0.05).VEGF质粒组各项指标水平均显著高于其余2组,P值均小于0.05.(2)术后14 d起转染细胞组真皮替代物中HUVEC明显多于其他3组.术后14 d,各组真皮替代物中每200倍视野中微血管数量:生理盐水组(4.2±1.1)个、培养基组(5.2 ± 1.1)个、未转染细胞组(6.6±0.9)个、转染细胞组(13.8±0.8)个,4组间比较,差异有统计学意义,F＝17.96,P＜0.01;转染细胞组微血管数量明显多于其余3组(P值均小于0.05).真皮替代物上VEGF 165蛋白相对表达量比值:术后7 d起,转染细胞组显著高于生理盐水组(P＜0.05)；术后14、21 d未转染细胞组(1 652±0.086、2.152 ±0.062)与转染细胞组(2.403 ±0.091、2.879±0.047)均显著高于生理盐水组(1.299±0.027、1.362±0.103,P值均小于0.05),且转染细胞组明显高于未转染细胞组(P值均小于0.05).各组真皮替代物中VEGF 165蛋白含量均随术后时间延长而增加. 结论 VEGF 165基因转染使HUVEC持续高表达VEGF 165蛋白,可有效促进真皮替代物体内血管化.